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4-香豆酸:辅酶 A连接酶(4CL) 试剂盒说明书
时间:2020-08-31 点击次数:45

分光光度法 50/24

正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

4CL 是连接苯丙酸途径与木质素特异合成途径的关键酶,主要催化肉桂酸生成相应的肉桂酸

辅酶 A 酯,是合成木质素与其他苯丙烷类化合物的代谢流向调控点。该酶主要存在于高等

植物、酵母和菌类中,研究该酶可以探讨多种生物细胞发育过程中木质素沉积的代谢机理,

为减少水果石细胞含量而提高其品质提供依据。

测定原理:

4CL 催化 4-香豆酸和 CoA 生成 4-香豆酸 CoA,在 333nm 下测 4-香豆酸 CoA 生成速率,即

可反映 4CL 活性。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制:

提取液:60mL×1 瓶,4℃保存;

试剂一:液体 60 mL×1 瓶, 4℃保存;

试剂二:粉剂×2 瓶,-20℃保存;

粗酶液提取:

细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量

   (104 个):提取液体积(mL)为 500~10001 的比例(建议 500 万细菌或细胞加       入 1mL 取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超  3s,间       隔 10s,重复 30  );8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL) 15~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

测定步骤:

1 分光光度计 40℃预热 30min 以上,调节波长至 333nm,蒸馏水调零。

2 样本测定

1)在试剂二中加入 12.5mL 试剂一充分溶解混匀,置于 40℃水浴预热 10min;现配现用

(配好后 24h 内用完);

2 测定管:在 1mL 石英比色皿中加入 50μL 样本和 950μL 试剂二,混匀,立即记录

333nm  40℃反应 30min 后的吸光值 A2

对照管:在 1mL 石英比色皿中加入 50μL 样本和 950μL 试剂一,混匀,立即记录

333nm  40℃反应 30min 后的吸光值 A1,计算 ΔA=A2-A1

注意:每个测定管设一个对照管。

 

4CL 活性计算:

1)按样本蛋白浓度计算:

单位定义:每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol4-香豆酸辅酶 A 定义为一个酶活力单位。

4CLnmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷ε×d×109]÷(V ×Cpr) ÷T=31.75×ΔA÷Cpr

2)按样本鲜重计算:

单位定义:每 g 组织每分钟生成 1 nmol 4-香豆酸辅酶 A 定义为一个酶活力单位。

4CLnmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷ε×d×109]÷(W ×V ÷V 样总) ÷T=31.75×ΔA÷W

3)按细菌或细胞密度计算:

单位定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol 4-香豆酸辅酶 A 定义为一个酶活力单位。

4CLnmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反总÷ε×d×109]÷(500×V ÷V 样总) ÷T=0.063×ΔA

V 反总:反应体系总体积,1×10-3 Lε4-香豆酸辅酶 A 摩尔消光系数,2.1×104 L / mol /cm

d:比色皿光径,1cmV 样:加入样本体积,0.05 mLV 样总:加入提取液体积,1 mL

T:反应时间,30 minCpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本质量,g500:细菌或细

胞总数,500 万。

 

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